澄清过滤：外泌体样本预处理与标准化
01 样本类型与预处理方案
为兼顾不同来源外泌体的处理需求，澄清方案如下表5所示：
02 Pmax标准化操作流程
1. 系统组装与参数设置
· 装置搭建
按Pmax要求组装过滤系统（泵→压力传感器→过滤器→收集罐），优先选择深层滤膜包（如1070PE）或PP囊式滤器。
· 通量匹配：
贴壁样本控制在150~200LMH；悬浮/植物/乳源控制在100~150LMH；
· 滞留体积测定：
以去离子水预充管路，设置初始通量150LMH，排空空气后测定滞留体积（15-45mL），用于后续产率校准。
2. 过滤过程的过程控制
Pmax操作步骤如下表6所示：
3. 数据分析与放大计算
· 绘制阻力-载量曲线：
以载量（L/m²）为X轴，过滤阻力（psi）为Y轴绘制数据（图1）。
· 安全系数与安装面积：
推荐安装面积：Arecommend = Amin × 1.5。实际安装面积(Ainstall)需≥Arecommend，并计算安全系数(SF= Ainstall / Amin)。
超滤换液：工艺适应性测试
01 中空纤维选型
外泌体具有柔韧性和可变形性，在外部压力（如跨膜压TMP）或剪切力作用下，外泌体可发生暂时性形变（如压扁或拉伸），压力大小及缓冲液性质（如粘度、离子强度、渗透压）也会影响形变，这些因素会导致外泌体缩小表观尺寸，从而通过比其标称直径更小的膜孔。故需结合实验数据进行中空纤维膜孔选择和工艺参数的优化。
结合应用端数据，外泌体超滤选型如下表所示：
02 确认最佳剪切速率
· 目标：
确定兼顾高通量与外泌体稳定性的剪切速率范围。
· 剪切速率设置：
分别设置切向流量对应的剪切速率为2000 s⁻¹、3000 s⁻¹、4000s⁻¹保持跨膜压（TMP）恒定（初始建议3~7psi）。
· 监测指标：
平均通量（LMH）：记录单位膜面积透出液流量。
工艺时间：完成相同浓缩倍数所需时间。
· 外泌体稳定性：
粒径分布：通过NTA或DLS检测处理前后外泌体平均粒径及分散系数（PDI）
标志物完整性：WB检测CD63、TSG101等标志物表达量。
形态观察：冷冻电镜（Cryo-EM）观察外泌体结构是否破裂或聚集。
· 结论判断：
选择通量高、工艺时间短且外泌体稳定性（PDI<0.2，标志物回收率>90%）的最佳剪切速率。
03 确认最佳TMP
最佳跨膜压（TMP）摸索
·目标：
确定避免外泌体穿透且通量最大化的TMP范围。
·实验设计：
TMP梯度设置：
根据料液黏度差异（如高黏度乳源外泌体 vs 低黏度MSC来源），设置TMP梯度：
①低黏度料液：3psi、5psi、7psi。
②高黏度料液：10psi、15psi、20psi。
监测指标：
通量-TMP曲线：绘制通量随TMP变化的趋势，识别压力不相关区拐点。
外泌体穿透率：
①透出液中外泌体含量检测（NTA或ELISA定量标志物）；
②穿透率要求：<5%（基于初始总颗粒数）。
浓差极化评估：
通量下降速率与TMP的关联性。
结论判断：
选择拐点前TMP值（通量仍处于压力相关区），并确保无显著外泌体穿透。
04 确认最佳浓缩倍数及透析倍数
·目标：
平衡通量、工艺时间、杂质去除率与外泌体活性。
·实验设计：
浓缩倍数优化：
设定目标浓缩倍数：5×、10×、15×（需要考虑高倍浓缩时进行透析带来的渗透压影响）
监测指标：
①外泌体回收率（NTA或ELISA）。
②杂质残留（总蛋白浓度检测，如BCA法）。
③外泌体聚集风险（PDI变化）。
透析倍数优化：
采用等体积透析（DF）模式，设定透析倍数：3×、5×、7×（缓冲液体积倍数）。
监测指标：
①杂质去除率（HCP检测、pH或电导率变化）；
②外泌体回收率及活性（标志物表达）。
结论判断：
选择回收率>90%、杂质去除率>95%的浓缩与透析组合参数。
05 中空纤维操作步骤
流程如下：
超滤换液：组件安装→水冲洗（纯化水）→0.5mol/L NaOH消毒→水冲洗（纯化水）→水通量测试→完整性测试→Buffer平衡→TMP优化→浓缩换液（透析步骤检测电导/pH）→顶洗回收→Buffer冲洗→水冲洗→0.5mol/L Na清洗→水冲洗→水通量测试→完整性测试→0.1mol/L NaOH保存；
（1）系统组装与预处理：
安装中空纤维柱（根据MWCO选择），连接泵、压力传感器、循环罐。用超纯水冲洗系统至无气泡，进行碱消毒及水冲洗后，测试使用前水通量，并进行完整性测试，再用缓冲液平衡3~5分钟。
（2）参数初始化：
设置初始剪切速率（如3000 s⁻¹）、TMP（如0.8 bar）。启动切向流循环，循环3~5分钟。
（3）浓缩阶段：
调节回流端阀门，控制TMP。实时监测通量、压力及料液体积，记录工艺时间。
（4）透析阶段
切换至等体积透析模式，以恒定速度加入透析缓冲液。监测电导率至稳定（杂质置换完成标志）。
（5）收样与清洗：
收集截留液（外泌体产物），检测回收率及杂质残留。用0.5 M NaOH清洗膜柱，并用超纯水冲洗，测试使用后水通量，评估膜柱清洗效果；并进行完整性测试，确保中空纤维膜无破损。使用后的中空纤维可使用0.1mol/L NaOH进行保存。
质量控制
01 物理特性检测
粒径与浓度：
①方法：纳米颗粒追踪分析(NTA)、动态光散射(DLS)。
②标准：粒径分布(30-150 nm)，多分散指数(PDI<0.2)。形态完整性：透射电镜(TEM)观察囊泡结构。
02 生化特性检测
标志物鉴定：
①阳性标志物：CD9/CD63/CD81(ELISA/Western Blot）。
②阴性标志物：Calnexin/细胞色素C(排除细胞碎片污染)。
核酸含量：
①RNA：qPCR检测miRNA或总RNA浓度(RIN>7)；
②DNA：基因组DNA残留量(<5%)。
03 安全性检测
内毒素：鲎试剂法（LAL），药品级需<0.25 EU/mL。
无菌性：微生物限度检查（膜过滤法，需符合药典标准）。
宿主蛋白残留：BCA法或ELISA检测（根据来源设定阈值）。
04 功能验证
生物活性：
①细胞摄取实验(荧光标记外泌体+流式/共聚焦显微镜分析)；
②体外功能验证(如干细胞外泌体促迁移/抗炎活性)。载药效率(如适用)： HPLC/UPLC定量包封率与载药量。
外泌体作为一种新兴的生物载体，其工艺与质量的研究仍在不断探索和完善，以推动其在生物医药、医美等领域的应用进程。外泌体的分离、纯化及其质量控制是研究和应用的关键环节。随着技术的不断进步，外泌体的产业化进程也会大大加快。在制药领域，市场将会建立标准化的外泌体生产和质量控制体系，以确保其临床应用的安全性和有效性。
